先锋转录因子FoxA1沉默诱导大肠癌细胞上皮间质转化研究

【摘要】研究背景大肠癌是我国常见的发病率呈明显上升趋势的恶性肿瘤之一,居肿瘤死因的第4位,目前的五年生存率徘徊在50-60%左右,浸润转移等恶性生物学行为是治疗失败的原因。迄今对大肠癌浸润转移和复发机制尚待深入,阐明大肠癌浸润转移和复发机制是开展有效治疗的基础,对提高大肠癌患者的生存期限和生活质量有重要意义。上皮间质转化(epithelialmesenchymaltransition,EMT)是指在特定的生理和病理情况下,具有极性的上皮细胞向具有移行能力的间充质细胞发生转化的现象。在EMT过程中,上皮细胞发生表型转化,最终成为成纤维细胞样的间质细胞表型,导致细胞极性消失、细胞间连接松散,同时细胞表型标志物发生改变,上皮表型如角蛋白丝、E-钙粘蛋白(E-cadherin)丧失,而获得波形蛋白(Vimemin)、纤维连接蛋白、N-钙粘蛋白等间质表型的表达。其中E-cadherin水平的下降可以导致细胞的粘附力降低,使细胞获得易于侵袭和转移的特性,E-cadherin表达的丢失已经被认为是EMT最显著的特征。近来EMT与肿瘤侵袭与转移相关的研究成为了研究热点。依据EMT的特定生生物学环境、功能的不同及其对机体的不同影响将其大致分为3种类型：Ⅰ型EMT与胚胎发生、器官发育相关,Ⅱ型EMT与创伤愈合、组织再生和器官纤维化相关,Ⅲ型EMT与肿瘤侵袭和转移相关,这型EMT发生于部分恶性肿瘤细胞中,肿瘤上皮细胞通过EMT获得了很强侵袭和转移能力,随血流转移至不同部位,进一步通过间质上皮转化(mesenchyalepithelialtransition,MET)过程形成上皮细胞的肿瘤转移灶,目前在上皮来源的肿瘤中,如卵巢癌、乳腺癌、口腔癌、食管癌、鼻咽癌、大肠癌等都可以监测到EMT过程,EMT在肿瘤的演进和转移中的作用是瞬时和可逆的,EMT过程受到了Snail,Slug,NF-KB,Twist等多种转录因子的调控。先锋转录因子FoxAl是一个转录因子FoxA家族中的一员,它通过和靶基因染色体序列的启动子或者增强子结合,诱导核小体结构重排使后续的转录因子能结合在染色质上从而促进靶基因的转录。FoxAl在生命体早期发育器官形成、成体的代谢和稳态维持、肿瘤的发展方面都具有重要作用。在乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌的研究中发现FoxAl与肿瘤的侵袭和转移呈负相关并且能够调控肿瘤上皮细胞和间质细胞的转化,其在大肠癌浸润发展中的作用迄今尚未见报道。实验目的拟在先前研究的基础上,研究FoxAl在大肠癌组织中的表达情况,并通过基因表达谱芯片技术分析大肠癌细胞中FoxAl沉默后基因表达谱的变化,为研究FoxAl在大肠癌浸润转移中的作用机制和寻找新的生物学标记及靶向治疗药物提供基础。实验方法1.免疫组化二步法分析31例大肠癌临床样本中FoxAl的表达分布。2.通过将大肠癌细胞系SW620感染重组慢病毒的方法敲除FoxAl,并用有限稀释克隆法建立稳定沉默细胞系；通过瞬时转染技术在293T细胞中过表达FoxAl。3.用WesternBlot的方法分别对比FoxAl沉默SW620细胞和正常表达的SW620细胞中EMT相关基因的表达和FoxAl过表达的293T细胞和正常293T细胞EMT相关基因的表达。4.提取FoxAl沉默的SW620细胞和正常表达的SW620细胞的mRNA逆转录成cDNA后做基因表达谱芯片分析。5.基因芯片的结果用DAVID软件和atBIONET软件进行GO分析、pathway分析和网络分析。实验结果1.FoxAl在31例大肠癌组织样本中都呈强阳性表达,其表达主要位于大肠癌上皮细胞内,间质细胞不表达FoxAl。其中部分大肠癌上皮细胞内FoxAl表达降低或缺失,可能与发生EMT有关。2.用Westernblot的方法发现大肠癌细胞SW620细胞中FoxAl沉默后上皮表型标志物E-钙粘蛋白(E-cadherin)表达下调,间质表型标志波形蛋白(Vimentin)表达上调；293T细胞中过表达FoxAl后,EMT诱导转录因子Slug和Snail表达水平均下降,提示FoxAl沉默可以诱导EMT发生。3.经HumanGenomeU133Plus2.0Array基因表达谱芯片分析,FoxAl沉默组和对照组之间有1469个差异表达基因,其中666个基因FoxAl沉默后表达上调,803个基因表达下调。其中间质同源框蛋白2基因(MEOX2)相对上升了67.76倍,神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂基因(SERPINI1)上升了33.05倍,核糖体蛋白S6基因(RPS6)下降了98.04倍,细胞因子样蛋白1基因(CYTL1)下降了77.13倍,白细胞活化粘附分子基因(ALCAM)下降了57.10倍。4.GO分析提示差异表达的基因的功能分类主要集中在细胞粘附、发育和结合等方面；Pathway分析显示差异基因参与的信号通路主要有肿瘤相关信号通路,黏着斑信号通路,胰岛素信号通路等；网络分析预测了差异表达基因中的潜在的分子标志物。结论1.部分大肠癌上皮细胞内FoxAl表达缺失可能与发生上皮间质转化有关。2.大肠癌细胞中FoxAl沉默后诱导了EMT发生。3.生物信息学分析表明FOXAl及其相互作用基因主要与细胞粘附、细胞固有膜组成、DNA结合等功能相关,差异基因主要参与了与癌症相关通路、粘附斑信号通路和细胞外基质受体信号通路,说明FOXAl诱导EMT发生可能是通过调节这群基因的表达变化来起作用。
【作者】朱琳琳；
【导师】毛建山；
【作者基本信息】浙江大学，消化内科，2014，硕士
【关键词】大肠癌；FoxA1；转录因子；上皮间质转化；基因芯片；GO分析；

【参考文献】
[1]林淼.黄岑苷对大鼠肾脏缺血再灌注损伤保护作用及机制研究[D].复旦大学,临床医学,2013,博士.
[2]单傲.通山县高标准基本农田划定研究[D].华中师范大学,土地资源管理,2014,硕士.
[3]祝庚.铁路信号计算机联锁系统的故障模型建立及故障诊断方法的研究[D].合肥工业大学,计算机应用技术,2003,硕士.
[4]梁峻铭.CCHP中微型燃气轮机发电系统的仿真及效率计算[D].广西师范大学,系统理论,2013,硕士.
[5]朱宏琨.国内IT员工工作满意度研究[D].大连理工大学,企业管理,2004,硕士.
[6]寻兴秀.城乡统筹视域下农村社会保障体系建设[D].山东财经大学,社会保障,2012,硕士.
[7]李立军.城市雨水管网系统优化设计研究[D].湖南大学,市政工程,2003,硕士.
[8]刘直芳,游志胜,张继平,曹刚,徐欣.利用人眼感知视觉模型的车型动态定位[J].控制与决策,2003,05:619-622.
[9]王芳.缅甸大选后的政治发展及对中缅关系的影响[D].厦门大学,国际关系,2014,硕士.
[10]马云飞.苦物质对气管平滑肌的影响及其信号通路的研究[D].中南民族大学,应用生物化学,2013,硕士.
[11]冯光光.基于40Cr表面（Ti,Al）N薄膜最佳工艺及组织分析[D].江苏科技大学,材料加工工程,2013,硕士.
[12]肖香梅.基于有限元的地图综合算法及其在LBS中的应用[D].浙江理工大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[13]宋海斌,马在田,张关泉.层状弹性介质三参数同时反演[J].石油地球物理勘探,1996,01:1-7+166.
[14]常乃超,何光宇,梅生伟,阮前途.注入空间中电压安全域最短半径的估计[J].电力系统自动化,2008,03:1-3+86.
[15]左丽华.北京市西城区投融资平台负债预测及预警体制研究[D].北京交通大学,2014.
[16]张家昌,马从权,刘文山.BIM和RFID技术在装配式建筑全寿命周期管理中的应用探讨[J].辽宁工业大学学报(社会科学版),2015,02:.
[17]朱梦婕.黄土画派艺术思想研究[D].渤海大学,美术学,2014,硕士.
[18]张玉梅.多媒体技术与高中思想政治课情境教学整合研究[D].沈阳师范大学,课程与教学论,2013,硕士.
[19]邵锦浩.罪名确定权合理归属研究[D].南京师范大学,法律,2012,硕士.
[20]朱帅虎.低透气性煤层粉乳炸药预裂爆破增透实验及工艺研究[D].中国矿业大学（北京）,安全技术及工程,2014,博士.
[21]李石力.烟草挥发物与性信息素引诱小地老虎的协同增效作用研究[D].西南大学,农药学,2013,硕士.
[22]李卫华,张承烈.泡泡刺叶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶季节性聚态变化[J].植物生态学报,2000,03:284-288.
[23]东升.北极褐藻酸裂解酶分泌菌株的多样性分析和褐藻酸裂解酶的成熟与催化机制研究[D].山东大学,微生物学,2014,博士.
[24]蒋进科,方宗德,贾海涛.对角修形斜齿轮设计与数控磨齿研究[J].机械工程学报.
[25]曹雪明.黄连素预处理对H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤保护作用的机制研究[D].南方医科大学,内科学,2014,博士.
[26]魏乐.横向并购纵向传染机制研究[D].北京交通大学,会计学,2014,博士.
[27]陈德伟.GF（2～n）上椭圆曲线密码体制的研究[D].西南交通大学,密码学,2003,硕士.
[28]刘华伟.上海房地产宏观调控对策研究[D].华东师范大学,政治经济学,2004,硕士.
[29]夏竹,张振生,孙长虹,陈耿毅,程怡.利用频率属性识别和划分陆相盆地多期时频层序——以松辽盆地乾西北地区下白垩统青山口组—姚家组为例[J].石油地球物理勘探,2004,06:730-738+627-751.
[30]付举磊,刘文礼,郑晓龙,樊瑛,汪寿阳.基于文本挖掘和网络分析的“东突”活动主要特征研究[J].自动化学报,2014,11:2456-2468.
[31]郭溦,褚叶祺,吴悦,金深海.大学生创业研究——兼论社会化媒体平台的功能[J].浙江工业大学学报(社会科学版),2013,01:99-106.
[32]郭垚垚.渠首水电站厂内经济运行研究与应用[D].华中科技大学,水利工程,2013,硕士.
[33]彪仿俊.建筑物表面风荷载的数值模拟研究[D].浙江大学,2005.
[34]陈一虎.基于网络的化学自主学习研究[D].华东师范大学,课程与教学论,2003,硕士.
[35]李延娜.济南市城市快速路规划布局研究[D].山东建筑大学,道路与铁道工程,2013,硕士.
[36]黄悦.基于公交IC卡信息的大站快车调度方法研究[D].西南交通大学,交通运输工程,2012,硕士.
[37]陈礼芬.英汉语中一些“非常规”用法的非范畴化[D].华侨大学,英语语言文学,2013,硕士.
[38]杨春光.企业核心竞争力培育研究——阜新煤矿个案分析[D].吉林大学,工商管理,2004,硕士.
[39]李晓斌周秀媛.单独招生在线报名系统设计和实现[J].电子技术与软件工程,2015,05:73.
[40]李倩倩.从山核桃蒲壳中提取酸洗缓蚀剂的研究[D].华东交通大学,分析化学,2013,硕士.
[41]张淑.模拟失重对比目鱼肌凋亡的影响及药物干预研究[D].新乡医学院,神经病学,2012,硕士.
[42]蒋翼.基于回声提述论的英语言语反讽研究[D].浙江工商大学,外国语言学及应用语言学,2014,硕士.
[43]蔡淇森.带二维装箱约束的异构车辆路由问题的混合启发式算法研究[D].厦门大学,计算机软件与理论,2013,硕士.
[44]尹青松.DLBL相关抗原特异TCR基因修饰T细胞的研究[D].暨南大学,2009.
[45]杨彦芬.企业所得税税率税基的国际发展趋势及对我国的改革[D].浙江财经学院,财政学,2013,硕士.
[46]范珉.建设领域拖欠工程款问题解决机制研究[D].西安建筑科技大学,管理科学与工程,2004,硕士.
[47]王建波.多孔钢板抗小口径动能弹效能分析与仿真[D].南京理工大学,材料工程,2012,硕士.
[48]付少军.抽象行政行为司法审查的法理之维[D].中共中央党校,法学理论,2004,硕士.
[49]王立.浙江省股权投资业发展问题与对策研究[D].吉林大学,工商管理,2013,硕士.
[50]朱红元.手性二苯甲基哌嗪类化合物的合成及其抗变态反应活性[D].广西大学,应用化学,2004,硕士.